Plazmid

?Przykładem specjalnie skonstruowanego plazmidu do przenoszenia genów, czyli tak zwanego plazmidu wektorowego, jest pBR 322. Ta niewielka, kolista cząsteczka zawiera 4361 par nukleotydów, a więc tyle co DNA najmniejszych bakteriofagów, ma geny oporności na antybiotyki: ampicylinę i tetracyklinę oraz pojedyncze miejsca cięcia dla nukleaz: Eco I, Pst I, Hin III, Bam I i Sal I. Rozcięcie plazmidu w tych miejscach i włączenie tam obcego DNA nie niszczy początku replikacji plazmidu. Jednak wstawienie obcego DNA w miejsce Pst I niszczy gen oporności na ampicylinę. Z kolei miejsca cięcia Hin III, Bam I oraz Sal I zlokalizowane są w genie oporności na tetracyklinę i włączenie do nich fragmentu DNA dawcy znosi oporność na antybiotyk w bakteriach, które pobrały taki zmodyfikowany plazmid. Transformację przeprowadza się w takich warunkach, że pojedyncza komórka biorcy, np. Escherichia coli, pobiera tylko jeden plazmid naraz. Jeżeli znajduje się w nim sztucznie wstawiony odcinek DNA, ustanawia on osobny klon komórek. Dlatego mówimy, że fragment DNA został sklonowany. Po namnożeniu się plazmidy zawierające wstawiony fragment DNA można wyizolować z bakterii, a następnie, używając tej samej nukleazy restrykcyjnej — wyciąć sklonowane fragmenty. Ponieważ są one różne wielkością od pozostałego plazmidu, można je stosunkowo łatwo wydzielić w czystej postaci. Jednym z najbardziej typowych zadań inżynierii genetycznej jest sklonowanie pojedynczego genu. Fragmentacja DNA dawcy prowadzi zwykle do powstania wielu różnych odcinków, które później, po włączeniu do plazmidów wektorowych, zostaną sklonowane w bakteriach. Wśród tysięcy kolonii bakteryjnych trzeba jednak odszukać tę, która zawiera interesujący nas gen. Opracowano wiele metod służących do identyfikowania sklonowanych genów. Jedna z nich wykorzystuje tak zwane sondy molekularne — radioaktywne cząsteczki polinukleotydów (np. mRNA), komplementarne do poszukiwanego genu.

No comments

Leave a reply

You may use these HTML tags and attributes: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>